核酸检测技术作为现代生物检测的重要手段，在食品安全监测、转基因成分鉴定和环境微生物检测等领域发挥着关键作用。当前主流的PCR检测技术虽然具有较高的准确性和灵敏度，但由于其对精密仪器设备、专业实验室环境和复杂操作流程的严格要求，在基层单位和现场检测场景中难以推广应用，严重制约了核酸检测技术在田间样品监测、食品安全监管等领域的实际应用效果。

近日，浙江省农业科学院农产品质量安全与营养研究所转基因溯源与安全评价团队在《Plant Biotechnology Journal》（IF=12.4）发表最新研究“An Ultra-Sensitive Quarantine Pathogen On-Site Detection Based on a One-Pot Asymmetric Recombinase Polymerase Amplification and MNAzyme-Assisted Target Recycling Biosensor (OAR-MNA)”。开发了一种基于非对称重组酶聚合酶扩增（aRPA）与MNAzyme联用的OAR-MNA检测系统。该系统突破了传统等温扩增技术依赖双链DNA产物而无法激活MNAzyme的技术瓶颈，方法具有20拷贝/μL的超高灵敏度，检测特异性显著优于传统RPA，且单次检测成本降低50%。配套研发的便携式检测设备可通过充电宝供电，实现从样品处理到结果输出的全流程现场检测，为核酸检测提供了高效、经济的解决方案。

OAR-MNA生物传感器工作原理示意图

该技术的核心创新在于巧妙地将非对称重组酶聚合酶扩增（aRPA）与多组分DNA核酶（MNAzyme）催化系统相结合。研究团队通过精确调控正向和反向引物的浓度比例，使反应体系在扩增初期快速生成双链DNA（dsDNA）模板，当限制性引物耗尽后自动切换为线性扩增模式，持续产生激活MNAzyme所需的单链DNA（ssDNA）产物。成功解决了传统等温扩增技术无法有效激活MNAzyme的关键技术难题。实验证实，标准RPA扩增产物无法激活MNAzyme信号系统，而通过优化引物比例获得的富含单链DNA的扩增产物则能产生显著的荧光信号，验证了该技术路线的可行性。

在方法学评价方面，OAR-MNA系统表现出卓越的检测性能。灵敏度测试显示，该方法对靶标DNA的检测限可达20拷贝/μL，在6个数量级的浓度范围内保持良好的线性关系（R²>0.99）。特异性评估结果表明，该技术对非靶标序列的识别具有高度特异性，与传统RPA方法相比，有效解决了非特异性扩增导致的假阳性问题。通过基因测序分析，研究人员揭示了该技术双重识别机制（引物特异性识别和MNAzyme特异性激活）带来的超高特异性优势。在经济性方面，该方法单次检测成本较传统荧光RPA降低约50%，具有显著的成本优势。

值得关注的是，该技术的平台通用性得到了充分验证。研究人员通过简单替换特异性引物和采用逆转录RPA（RT-RPA），成功将该技术拓展至RNA靶标的检测，证实了该方法在不同类型核酸检测中的广泛应用潜力。为满足现场检测需求，团队还配套开发了便携式检测设备，该设备采用充电宝供电，集成了精确温控和荧光信号读取功能，操作简便，可直接输出"阳性"或"阴性"的明确结果。在实际样品检测中，22份样品的现场检测结果与实验室标准qPCR方法完全一致，验证了该技术在实际应用中的可靠性。

浙江省农业科学院杨蕾博士和已毕业的浙江师范大学陈冠玮硕士为论文第一作者。浙江省农业科学院徐俊锋研究员、汪小福研究员以及浙江师范大学孙梅好教授为论文共同通讯作者。本研究得到了浙江省自然科学基金、浙江省农业与农村厅科研专项、浙江省科技专项的资助。

（来源：浙江省农业科学院）